Comment compter les cellules avec un microscope

Les cellules observées sur un coulisseau placé sous un microscope sont comptées en utilisant un outil de laboratoire commun connu comme un hématimètre, ou une chambre de comptage de cellules, en combinaison avec un colorant d'exclusion dit au bleu Trypan. Le colorant colore les cellules mortes bleu, mais ne peut pas entrer dans les cellules vivantes, qui apparaîtront plus lumineux, sphères blanches à travers l'oculaire du microscope. Les scientifiques ont besoin de compter les cellules afin de placer le bon nombre de cellules dans un milieu de culture cellulaire ou le réactif expérimental pour la quantification et l'analyse ou tout simplement pour empêcher les cellules de mytiliculture.


Sommaire

  • Instructions
  • Conseils & avertissements
  • Choses que vous devez

    • une solution saline tamponnée au phosphate
    • Hémacytomètre et lamelle
    • Eau distillée
    • Solution de bleu Trypan
    • Compteur manuel
    • Microscope calibré
    • Trypsine



    • Sérum
    • outils et consommables de laboratoire (pipettes, des conseils de filtre, de tubes, Kimwipes, éthanol à 70%, blanchiment, etc.)
    • machines et accessoires de laboratoire (table centrifugeuses, hotte à flux laminaire, etc.)
    • Équipement de protection individuelle




    • Cellules
    • milieux de croissance cellulaire
    • Système d'évacuation Biohazard

    Instructions

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      Déterminer le type de hémacytomètre (par exemple Neubauer) étant utilisé. Ce sont essentiellement des lames de microscope épaisses contenant une zone centrale gravé avec des grilles de comptage. Placez ce mettre sous le microscope à un faible grossissement (10-20x) et la mise au point des lentilles jusqu'à invidivual grilles de comptage sont visibles.

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      Préparer une suspension cellulaire. Utilisez l'enzyme trypsine pour briser le tissu en cellules individuelles, puis neutraliser la trypsine avec du sérum. Lavez et sédimenter les cellules, et remettre en suspension dans les médias ou une solution saline. Éliminer amas de cellules par pipetage doucement monter et descendre. Si la suspension est trouble, diluer davantage avec plus salée.

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      Utilisez le bleu Trypan pour exclure les cellules mortes. Transfert 10-20 microlitres de suspension cellulaire dans un tube stérile et mélanger avec le même volume exact de colorant bleu Trypan par pipetage. Cela dilue la suspension cellulaire 1: 2 dans le bleu Trypan.

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      Préparer le hemactyometer. Essuyez-les avec 70% d'éthanol, l'air sec et ensuite placer une lamelle sur les grilles de comptage. Dans le "drainer" dans la partie supérieure de chaque grille, placer 10 microlitres de suspension cellulaire et permettre la "drainer" de tirer au-dessous de la lamelle. Répéter cette autre grille de comptage jusqu'à ce que les deux ont une couche uniforme de suspension de cellules.

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      Comptez le nombre de cellules en utilisant le compteur manuel. Les cellules vivantes vont refléter la lumière et apparaît brillant, blanchâtre et sphérique. Les cellules qui sont bleus sont morts ou endommagés et ne doivent pas être comptées, sauf si le nombre de cellules non viables sont nécessaires. Répétez l'opération pour tous les 8 comptage grilles et ensuite prendre la moyenne. Par exemple, si 800 cellules sont comptées dans 8 grilles, puis la moyenne par grille correspond à 100 cellules.

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      Calculer la densité de cellules dans la suspension d'origine. Appliquer le nombre moyen de cellules à la formule suivante:
      La concentration cellulaire = nombre moyen de cellules X 10.000 x facteur de dilution (= 2, si la dilution est de 1: 2) volume de X de la suspension (en millilitres, ajuster au besoin pour microlitres et ainsi de suite).

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      Nettoyez le hématimètre. Laver la suspension cellulaire, essuyez le bas hémacytomètre l'eau de Javel et / ou isopropanol à 70%, ou une inondation avec 70% d'éthanol. Laisser sécher ou essuyer avec un chiffon non pelucheux et jetez tous les suspensions cellulaires indésirables dans des conteneurs à risque biologique.

    Conseils & Avertissements

    • Le bleu trypan est un mutagène et les taches de façon permanente, afin d'assurer que les vêtements de protection et des gants sont portés avant de poursuivre.
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