Comment calculer kcat

Dans les réactions chimiques catalysées par une enzyme, l'enzyme réduit la quantité d'énergie d'activation requise par collage avec le substrat temporaire et de torsion dans un état tendu. Le k (catalyseur) ou "kcat" pour que la réaction se réfère à la constante de concentration-indépendant de la vitesse à laquelle une enzyme particulière peut métaboliser un substrat en une molécule de produit. Pour calculer kcat, scientifiques première mélangent plusieurs tubes à essai avec des concentrations variables de substrat (connu comme une "dosage enzymatique") Et les tester à intervalles de temps constants avec un spectrophotomètre lumière pour mesurer les concentrations croissantes de molécules de produit. Ces données sont ensuite tracée sur un graphique et analysés.


Sommaire

  • Calcul de vitesses initiales
  • Calcul vmax
  • Choses que vous devez

    • Les données brutes provenant d'un essai enzymatique (à savoir, la concentration du produit en fonction du temps)
    1. Calcul de vitesses initiales

      • 1

        Tracer un graphique de la concentration du produit en fonction du temps pour les données du premier tube d'essai de l'essai enzymatique. Remarque: l'axe horizontal devrait être "temps," et l'axe vertical devraient être "concentration du produit."

      • 2

        Calculer la droite de régression linéaire pour les points de données que vous avez tracé dans la section 1, étape 1. Alors que Excel et calculatrices graphiques peuvent facilement déterminer ce modèle linéaire, vous pouvez obtenir une estimation de la pente de la droite de régression en divisant la différence de concentration du produit entre les données adjacente des points par leur différence dans le temps.




      • 3

        Enregistrez la pente de la droite de régression linéaire de la section 1, étape 2 comme "vitesse de réaction initiale (Vo)." Remarque: dans le modèle de la ligne de régression "[Concentration du produit] = m [temps] + b," le coefficient "m" est la pente.

      • 4

        Répéter les étapes 1, 2 et 3 pour le reste des tubes à essai dans l'essai.

      • Calcul Vmax

        • 1



          Tracer l'inverse de la concentration du substrat pour chaque tube à essai par rapport à l'inverse de sa vitesse initiale de réaction (de la section 1, étape 4). Par exemple, si la vitesse initiale pour un tube à essai avec une concentration initiale de substrat de 50 micromolaire (uM) était de 80 pM / s, les inverses seraient 1/50 pM de la concentration du substrat et 1/80 pM / s pour la première vitesse. Remarque: la concentration du substrat inverse doit être sur l'axe horizontal, et la vitesse initiale inverse doit être sur l'axe vertical.

          Remarque: la concentration du substrat doit être sur l'axe horizontal, et de la vitesse initiale de la réaction doit se trouver sur l'axe vertical.

        • 2



          Déterminer la droite de régression linéaire pour le tableau que vous avez tracé à la section 2, l'étape 1. Remarque: parce que vous aurez besoin de connaître l'y intersection de la ligne de régression, vous devez saisir les points de la section 2, l'étape 1 dans Excel ou un calculatrice graphique et utiliser la fonctionnalité de modélisation de régression intégré.

        • 3

          Diviser une par l'ordonnée à l'intersection de la droite de régression linéaire. Cela vous donnera la valeur de l'inverse de Vmax, la vitesse maximale de réaction pour l'enzyme. Remarque: si le modèle de régression linéaire prend la forme "[Inverse Vo] = m [Inverse Substrat Conc.] + B," puis la valeur de "b" serait le y-croisent. Diviser 1 par "b" pour calculer l'inverse de Vmax.

        • 4

          Diviser 1 par le résultat de la section 2, l'étape 3 pour calculer la valeur réelle de Vmax.

        • 5

          Déterminer la concentration de l'enzyme dans l'essai d'origine (voir les données brutes). Remarque: la concentration de l'enzyme est la même pour l'ensemble des tubes- de test que les concentrations varient de substrat dans le dosage.

        • 6

          Diviser la Vmax (à partir de la section 2, étape 4) par la concentration de l'enzyme (à partir de la section 2, étape 5). Le résultat est la valeur de Kcat.

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