Comment isoler l'ARNm d'une cellule

Isolement de l'ARNm de l'ARN total

1. TRIzol homogénéisation: ARN total inclut tous les ARNm, ARN de transfert, de l'ARN ribosomal, et d'autres ARN non codantes. Pour les séparer des autres composants cellulaires, la cellule est d'abord éclaté ouvert à libérer son contenu. Cela se fait par remise en suspension des cellules en culot par centrifugation (filage à des vitesses élevées) dans le réactif TRIzol (Life Technologies). Autres versions de TRIzol (comme réactif TRI de Ambion) fonctionnent de manière similaire.

2. Isolement de l'ARN total: Une série de centrifugations est utilisé pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule dans des couches ou phases, au sein de la suspension. Le haut, la phase de couleur jaune est composé de graisse et peut être jeté. La phase souhaitée est teinté rouge, contient l'ARN total et est retenu. Après avoir effectué une extraction au phénol-chloroforme et une série de lavages à l'alcool en utilisant de l'isopropanol et l'éthanol, l'ARN peut être pastillé pour l'isolement de l'ARNm. Ajouter inhibiteurs de RNase pour empêcher cette enzyme de dégradation de l'ARN total.

3. ARNm Extraction: Il est courant d'utiliser un kit pour isoler des ARNm, que les protocoles de laboratoire faits maison ne génèrent pas de grandes quantités d'ARNm hautement purifiés. Des kits commerciaux comprennent FastTrack 2.0 ou Ambion de Poly Invitrogen (A) Kit d'isolement d'ARNm pur. Ces étapes de base sont communs à ces kits:

   a) Mélanger le tampon de lyse RNase inhibée fourni dans le kit avec un maximum de 300 microlitres d'ARN total.

   b) la chaleur pendant 5 minutes à 65 degrés Celsius, puis refroidir immédiatement l'échantillon sur de la glace pendant une minute.

   c) Mélangez cela avec 0,5 M de chlorure de sodium, puis dissoudre complètement Oligo dT (acide oligodeoxythymidylic) dans cet échantillon.

   d) centrifuger l'échantillon et récupérer le surnageant, que l'on lave plusieurs fois dans une série de tampons de liaison et de sel faible fournis dans les kits.

   e) Elute ARNm plusieurs fois jusqu'à un volume de kit-spécifiée (par exemple, 500 microlitres) est obtenu.

   f) faire précipiter le éluat par l'acétate de sodium et précipitation à l'éthanol. Re-suspendre jusqu'à 20 microlitres de diéthylpyrocarbonate d'eau -Traité (de DEPC).

   g) Conserver à -80 degrés Celsius et vérifier la qualité et la quantité par spectrophotométrie.

• Gardez tous les réactifs, les cellules et les ARN à froid par immersion dans de la glace. Cela empêche l'ARN d'être dégradée par des enzymes autres que devenir libérés au cours du processus d'homogénéisation.

• Réactifs tels que TRIzol sont toxiques et ne doivent pas être en contact avec la peau ou les muqueuses. Toujours respecter les protocoles de laboratoire sûrs lors de la manipulation de ce réactif.