Selon le site Bioweb de l'Université du Wisconsin, une amorce de PCR est un oligonucléotide synthétique court (généralement entre 18 et 25 bases de long) utilisées pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN dans une technique de biologie moléculaire connue sous le nom de réaction en chaîne de la polymérase (PCR). À la fois une amorce avant et arrière sont nécessaires, conçu pour être compléments inverses du brin d'ADN, à flanc et se lier à la région d'ADN souhaité. Quand les scientifiques veulent effectuer des recherches sur un gène ou une région d'ADN spécifique, ils doivent d'abord effectuer une PCR pour acquérir suffisamment de la région cible de travailler avec. Concevoir des séquences d'amorces pour la région d'intérêt peut être nécessaire si elles ne sont pas déjà disponibles grâce à la recherche publiée ou par des moyens commerciaux.
Obtenir la séquence nucléotidique de la région du gène ou de l'ADN d'intérêt et de décider combien de temps vous voulez un fragment à amplifier. L'amorce vers l'avant et de marche arrière est conçu pour se lier au début et à la fin du fragment souhaité. En règle générale, les méthodes de PCR conventionnels utilisent des amorces qui flanquent une région de 100 à 1000 paires de bases de long, alors que les méthodes de PCR en temps réel utilisent des fragments environ 50 à 200 paires de bases de long.
Décidez où dans la séquence que vous voulez que les amorces de mentir. Par exemple, vous voudrez peut-être l'emplacement près de l'extrémité 5 'ou l'extrémité 3' de la séquence ou au milieu. Si l'on désire désigner l'emplacement des amorces pour enjamber un intron.
Suivez les directives recommandées pour la conception d'amorce. Amplification réussie du produit de l'ADN dépend de la qualité des amorces et certaines variables sont critiques.
Concevoir des amorces d'être 18 à 24 bases de longueur. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., suggère que cette longueur est assez long pour être extrêmement spécifique à la région d'ADN souhaité, mais suffisamment courte pour lier (recuit) facilement. Primer température de fusion (Tm) doit se situer entre 55 à 80 degrés Celsius, suffisamment basses pour permettre une fusion complète ou au-dessus de 90 degrés Celsius, mais suffisamment élevé pour permettre le recuit. La teneur en GC (pourcentage de S et C dans la séquence) doit se situer entre 40 et 60 pour cent. L'extrémité 3 'de la séquence d'amorce ne doit se terminer par un C ou un G (appelé une pince GC) pour promouvoir la liaison, étant donné que les nucleotides G et C ont des liaisons plus fortes, toutefois, éviter d'avoir trois ou plus Gs ou Cs dans les cinq derniers bases de la séquence.
Évitez d'avoir des séries de quatre ou plus d'une base (comme ACCCC ...) ou quatre ou plusieurs répétitions di-nucléotidiques (comme ATATATAT ...) car ils peuvent causer mésamorçage. Conception des amorces avec aucune homologie intra-amorce (plus de trois bases complémentaires à l'intérieur de la une amorce elle-même) ou d'homologie entre l'amorce (où l'amorce directe et inverse ont des séquences complémentaires). Cela peut provoquer des auto-dimères ou des dimères d'amorces, où les amorces se lient à eux-mêmes au lieu de se lier à la séquence d'ADN souhaitée.
Utiliser les ressources en ligne et des sites Web qui aident à la conception amorce ou aident à vérifier les séquences d'amorce pour une auto-complémentarité ou le potentiel pour faire des structures secondaires, comme des épingles à cheveux. Certains sites Web de conception d'amorce comprennent Massachusetts Institute of Technology Primer3, Centre national pour Primer-Blast de biotechnologie de l'information et de OligoAnalyzer Integrated DNA Technologies.